ATEROTROMBOSIS. NUEVOS ABORDAJES PARA EL ESTUDIO DE LAS PLAQUETAS.

Lina Badimón/Teresa Padró

INTRODUCCION

La aterosclerosis (AT) es una enfermedad crónica de la pared vascular que empieza ya en la niñez y progresa de manera asintomática durante la vida adulta hasta que desencadena procesos aterotrombóticos y se manifiesta clínicamente, dando lugar a episodios cardiovasculares agudos como el infarto de miocardio (IM), el infarto cerebral (ACV), la gangrena o la pérdida de función de las extremidades. Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en mundo, originando casi el 38% de todas las defunciones.

Las plaquetas, son el principal componente celular en los procesos trombóticos asociados a placas ateroscleróticas rotas. Por ello, los tratamientos antiplaquetarios han adquirido una especial relevancia en la prevención de la enfermedad isquémica coronaria (EIC).¹ Sin embargo, cada vez mayor número de evidencias indican la importancia de investigar e identificar nuevas dianas terapéuticas que ayuden a reducir el impacto de las enfermedades de origen aterotrombótico.

En la era postgenómica, la aplicación de nuevas tecnologías, entre las que se incluye la proteómica, permite la identificación de patrones proteicos diferenciales en situaciones fisiopatológicas específicas. La integración de esta metodología con otras igualmente novedosas, como la genómica funcional y con técnicas bioquímicas clásicas, está revelando proteínas y vías moleculares que pueden llevar a nuevas alternativas en la prevención y tratamiento de la patología cardiovascular.

Fisiopatología de la plaqueta

Las plaquetas son componentes celulares que se producen en la médula ósea a partir de fragmentos citoplasmáticos de los megacariocitos, por lo que carecen de DNA genómico.² En ausencia de procesos de activación, las plaquetas permanecen en el torrente circulatorio durante unos 10 días, manteniéndose en estado quiescente, con un nivel mínimo de interacción con otros componentes celulares de la sangre y la pared vascular. Sin embargo, en presencia de estímulos externos, como puede ser la pérdida de endotelio vascular y la exposición de componentes de la matriz extracelular, como colágeno o factor de von Willebrand (vWF), que se unen a receptores de la superficie de la plaqueta, se inician complejos mecanismos de señalización y un amplio espectro de interacciones celulares.³ Las plaquetas, no sólo son los efectores celulares clave en el proceso de hemostasia primaria y mantenimiento de la integridad vascular, sino que intervienen también en procesos inflamatorios^4,5 y de respuesta inmune.⁶ Además, cada vez se conocen un mayor número de vías por las que las plaquetas contribuyen a la formación y progresión de las lesiones ateroscleróticas, así como a los procesos trombóticos que se producen tras la erosión o rotura de placas ateroscleróticas.^3,7

Activación plaquetaria

Los procesos de adhesión y agregación plaquetaria o la interacción plaqueta-leucocito, son consecuencia de mecanismos de activación, en los cuales participan diferentes proteínas de membrana (receptores, moléculas de adhesión etc.) y complejas vías de señalización. Como consecuencia de la activación plaquetaria, se secretan mediadores proteicos al microentorno, los cuales actúan de forma autocrina o paracrina (e.g mitogénos y factores de inflamación), induciendo la migración de leucocitos a la íntima vascular, así como mecanismos moleculares y funciones celulares con potencial efecto en la progresión y complicación de la patología cardiovascular.⁸

Independientemente del estímulo que produce la activación plaquetaria, ésta está regulada, en su vía final, a través de la activación del receptor plaquetar GPIIb/IIIa. Este receptor es la proteína más abundante en la superficie plaquetaria y está compuesto por 2 subunidades proteicas (la IIb y la IIIa). La activación de este receptor supone un cambio conformacional en las dos subunidades, de modo que exponen un dominio de unión RGD para diversos ligandos. El fibrinógeno (de origen plasmático o plaquetario), es la proteína que se une mayoritariamente al dominio RGD del receptor GPIIb/IIIa y su estructura dimérica permite su interacción con 2 plaquetas simultáneamente, favoreciendo así, la agregación plaquetaria y la trombosis. Existen otros ligandos de la GPIIb/IIIa que también participan, aunque en menor grado, en la interacción plaqueta-plaqueta como: son el FvW, la fibronectina, la vitronectina y el CD40 ligando.⁹

La identificación y caracterización de proteínas involucradas en las vías de señalización, así como en la interacción con receptores de membrana asociados a la activación y agregación plaquetaria, también como en el secretoma plaquetario y el estudio de su función, abre la posibilidad a nuevas dianas y estrategias farmacológicas en la terapia antiplaquetarias. De hecho, la búsqueda de nuevos fármacos antiplaquetarios, de mayor efectividad y con menores efectos secundarios, es un área punta en la investigación cardiovascular, tanto clínica como básica.¹⁰

Debido al carácter anuclear de las plaquetas, el análisis del proteoma es la mejor estrategia para el estudio de los mecanismos bioquímicos y moleculares relacionados con su función. La plaqueta retiene cierta cantidad de mRNA funcional proveniente del megacariocito y la maquinaria translacional necesaria para la síntesis de proteínas.¹¹ Sin embargo, sus niveles son muy reducidos, por lo que el análisis del transcriptoma puede verse enmascarado por interferencia de células contaminantes (eritrocitos, leucocitos) y los resultados pueden ser difíciles de interpretar debido a la continua disminución de los niveles mRNA en ausencia de transcripción génica.¹² La disponibilidad de utilizar las nuevas tecnologías para examinar el perfil proteico de una forma global e integrada, facilita el análisis de los factores determinantes y mecanismos moleculares involucrados en la función plaquetar y su respuesta a agentes antiplaquetares. El repertorio de proteínas de la plaqueta depende del perfil de expresión de sus precursores, por lo que las alteraciones en la regulación de respuestas plaquetarias, podrían estar condicionadas a cambios en los procesos de señalización de los megacariocitos y en las funciones de estos progenitores celulares. Esto hace que se abra una nueva perspectiva de investigación en la patología cardiovascular y terapia antiplaquetaria.

Aplicación de técnicas proteómicas en el estudio del perfil proteico plaquetario

La reciente secuenciación del genoma humano, ha puesto en evidencia que el grado de complejidad de los organismos, es consecuencia de un amplio espectro proteico.

El proteoma puede definirse como: un conjunto de proteínas, que incluyen todas sus isoformas y modificaciones postransduccionales (fosforilaciones, glicosilaciones, sulfataciones, etc), las cuales están presentes en una célula, tejido u organismo en un momento específico, bajo unas condiciones determinadas y son reflejo de su actividad funcional.¹³ El desarrollo de la tecnología proteómica, ha sido posible gracias al conocimiento y disponibilidad de bases de datos del genoma y a los avances, tanto técnicos como conceptuales, en diferentes áreas relacionadas con la separación e identificación de proteínas y de forma más específica, al descubrimiento y desarrollo de métodos sensibles y eficaces para la ionización de proteínas.¹⁴ Esto ha permitido que, las técnicas de espectrometría de masas, fueran adquiriendo cada vez mayor relevancia como métodos de elección en el análisis de complejas muestras de proteínas, hasta el punto de que hoy en día, es la herramienta primordial en los estudios proteómicos.

Como parte de la proteómica plaquetaria se entiende, no sólo el mapeo global del espectro de proteínas de la célula, sino también, la identificación y caracterización de proteínas asociadas a estructuras y relacionadas con funciones plaquetarias específicas, así como la disección de cascadas de señalización intracelular (Figura 1). El análisis proteómico, implica la separación e identificación desde varios cientos, a más de mil proteínas a un mismo tiempo, lo que se consigue mediante la técnica de electroforesis bidimensional (2DE) o cromatografía líquida multidimensional y espectrometría de masas (Figura 2, A y B)

Electroforesis bidimensional

La técnica de 2DE permite la separación de las proteínas de una muestra biológica, en una primera dimensión por isoelectroenfoque, en base a su punto isoeléctrico (pI), a lo largo de un gradiente de pH (por ejemplo, pH 3-10) y en una segunda dimensión, mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS), en relación a su peso molecular (PM).¹⁵ La reciente mejora en la sensibilidad y reproducibilidad de los estudios proteómicos basados en esta técnica electroforética, se debe a avances en esta metodología que incluyen, el desarrollo de tiras con diferentes gradientes inmovilizados de pH de reducidos intervalos (pH 4-5, 5-6 etc.), lo que permite analizar con detalle, las regiones de interés;¹⁶ la inclusión de nuevas sustancias caotrópicas y detergentes, que favorecen la solubilización de proteínas, especialmente las de membrana y la utilización de nuevos marcadores fluorescentes altamente sensibles y solubles en agua.^17,18 También la mejora en la sensibilidad y reproducibilidad de los equipos de escaneo y programas informáticos específicos de digitalización y análisis (PDQuest, Melanie, DeCyder etc).

Espectrometría de masas

Las proteínas de interés son extraídas de los geles y digeridas normalmente, con tripsina de forma que se genera un conjunto de péptidos ceracterísticos para cada proteína lo que permitirá, en función de sus masas,la identificación de la proteína de la que provienen, por espectrometría de masas, con ayuda de programas de búsqueda y potentes bases de datos (SWISS-PROT, TrEMBL). En proteómica se utilizan, fundamentalmente, dos tipos de tecnologías basadas en espectrometría de masas (MS): la conocida como MALDI-TOF (“matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) y las que incluyen sistemas de ionización por “electrospray” (ESI-MS)¹⁷ y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).¹⁹ Estas últimas son, además, las más utilizadas en procesos de identificación y caracterización de proteínas plaquetarias basadas en la secuenciación de péptidos originados por digestión con tripsina o en el análisis de modificaciones post-transduccionales como fosforilaciones o glicosilaciones.²⁰

El análisis global del proteoma de una célula, aunque analíticamente factible, presenta severas limitaciones debido al amplio rango dinámico en que se encuentran las proteínas: aproximadamente. diferencias de 5-log, entre las proteínas de mayor y menor abundancia. Así pues, el estudio de subproteomas específicos, representa una buena estrategia para mejorar la sensibilidad en el análisis del proteoma plaquetar y analizar su respuesta frente a estímulos externos.

Perfil proteómico de las plaquetas en estado basal.

La extracción secuencial de las plaquetas, basándose en la diferente solubilidad de las proteínas en tampones específicos,²¹ permite la separación del proteoma en fracciones subcelulares enriquecidas en (1) proteínas citosólicas, (2) proteínas del citoesqueleto y de membrana. Este procedimiento es suficiente para aumentar, de forma significativa (aproximadamente 2-3 veces), el número de “spots” proteicos detectados y reducir la complejidad de los sistemas proteicos facilitando su análisis. La figura 3, muestra, comparativamente, el patrón de distribución de proteínas obtenido por electroforesis bidimensional a partir de extractos enriquecidos en proteínas citosólicas y proteínas de membrana/citoesqueleto, obtenidos de plaquetas porcinas en estado basal.²² Dentro de un rango de pI de 5 a 8, se separan 543 “spots” proteicos en la fracción citosólicas y 356 en el subproteoma enriquecido en proteínas de membrana/citoesqueleto. En ambos subproteomas, los spots proteicos presentan un patrón de distribución similar en lo que refiere a PM (70% inferior a 65 kDa), mientras que la fracción enriquecida en proteínas de membrana/citoesqueleto, presenta un mayor número de spots proteicos a pH más ácidos que las proteínas de la fracción citosólica, lo que podría asociarse con un mayor número de formas fosforiladas en esta fracción (Figura 4).

Otros métodos de subfraccionamiento utilizados en el estudio del proteoma plaquetar incluyen: (1) anticuerpos específicos y técnicas de inmunoprecipitación para la obtención de subproteomas determinados;²³ (2) el empleo de lecitinas para la obtención de fracciones enriquecidas en glicoproteínas; la concavalina A (Con A) y la aglutinina del germen de trigo (WGA), se han utilizado ampliamente en la investigación de glicoproteínas;^24,25 y (3) técnicas de ultracentrifugación para la obtención de micropartículas. Estos fragmentos de membrana, liberados al medio tras la activación plaquetaria, han mostrado tener una elevada actividad procoagulante.^{26, 27} En un reciente estudio proteómico, García y colaboradores, han identificado 578 proteínas como constituyentes de este proteoma subcelular.²⁸ Tal y como se esperaba, muchas de éstas representaban proteínas plaquetarias ya caracterizadas. Sin embargo, aproximadamente 60% de las proteínas que identificaron, no se han descrito anteriormente en estudios del proteoma plaquetar, lo que sugiere que las micropartículas tienen una composición proteica peculiar.

En lo que refiere al proteoma plaquetario, es interesante remarcar que, el mayor grupo de proteínas identificado corresponde a proteínas de señalización (24%), seguido de proteínas involucradas en la síntesis y degradación de proteínas (22%). Se desconoce hasta el momento, si estas proteínas son importantes desde un punto de vista funcional o simplemente, se han incorporado a la plaqueta durante el proceso de segregación del megacariocito.²⁹

Perfil proteómico de las plaquetas activadas.

La activación de las plaquetas y adhesión a superficies vasculares desendotelizadas, implica cambios extremadamente rápidos y marcados en su morfología y composición. Así, las plaquetas pasan de tener una forma discoidal a presentar numerosos pseudópodos originados a partir de la membrana plasmática.³⁰ Se agregan y secretan su contenido granular. Desde un punto de vista proteómico, la activación plaquetar implica alteraciones en el nivel de detección y distribución compartimental de un gran número de proteínas, así como modificaciones a nivel postransduccional.

Resultados de nuestro grupo muestran que, la activación in in vitro de plaquetas con trombina (0,5 U NIH/mL), induce alteraciones en el 77% de las formas proteicas que se separan por 2DE en la fracción citosólica y en el 68% de las que se detectan en la fracción enriquecida en proteínas de citoesqueleto y membrana. Como se muestra en la Figura 5, en el citosol, el mayor porcentaje de modificaciones corresponde a proteínas que disminuyen su nivel de detección en una tasa superior a 2 (43%), mientras que en la fracción de citoesqueleto/membrana, el mayor número de proteínas diferenciales, son aquellas que han incrementado su nivel de detección (32%).

Entre los más de 300 tipos de modificaciones postrasduccionales que se han descrito hasta la fecha,³¹ las fosforilaciones juegan un papel primordial en la regulación de las cascadas de señalización que ocurre en las plaquetas. Basándose en técnicas de inmunoprecipitación, para poder analizar el proteoma de la fosfotirosina, Maguire y col., han identificado 76 formas proteicas en plaquetas activadas con trombina que no están presentes en plaquetas en estado de reposo.³² Un análisis proteómico amplio de las cascadas de señalización intracelular en la plaqueta requiere, sin embargo, la integración de diferentes metodologías de subfracionamiento y análisis. El marcaje de proteínas fosforiladas con P³², juntamente con electroforesis bidimensional, para la separación de proteínas y tecnología Maldi-TOF y nano-LC-MS-MS, como estrategias de análisis, ha permitido identificar diferentes isoformos de la pleckstrina, el mayor sustrato de la proteína kinasa C en la plaqueta, y varias proteínas citoesqueléticas, como componentes proteicos relevantes en plaquetas activadas.³³

De hecho, la reorganización del citoesqueleto, que ocurre durante el proceso de activación plaquetaria, abre nuevas perspectivas en el estudio de proteoma citoesquelético, ya que éste podría poner de manifiesto nuevas dianas terapéuticas dirigidas a impedir la pérdida de forma discoidal de la plaqueta durante su activación, evitando con ello, procesos derivados como: adhesión o agregación plaquetaria.

Análisis proteómico e identificación de nuevos mecanismos de acción de fármacos antiplaquetarios

Los fármacos nitrovasodilatadores, son ampliamente utilizados en pacientes con patología coronaria estable debido a su carácter vasodilatador.³⁴ Sin embargo, cada vez mayor número de evidencias atribuyen propiedades antiplaquetares a nuevos donadores de óxido nítrico (ON), sugiriendo un potencial beneficio antitrombótico para estos donadores. El análisis proteómico de plaquetas activadas in vitro con trombina, provenientes de animales tratados por vía oral, con dosis terapeúticas de un donador de ON, en forma de nitrato-tiol, durante un periodo de nueve días, pone de manifiesto la implicación, principalmente, de proteínas de señalización y del citoesqueleto, en los mecanismos de acción antiplaquetares inducidos por el donador de ON (Figura 6). Una de las proteínas de señalización identificadas que parece estar implicada en la pasivación plaquetar inducida por el donador de ON, es la proteína disulfido isomerasa (PDI).³⁵ Recientemente y como se muestra en la figura 7, nuestro grupo ha demostrado que en plaquetas activadas con trombina, aumenta la secreción de PDI de la superficie de la plaqueta, lo que podría facilitar la interacción plaqueta-plaqueta y subsiguientemente la agregación plaquetaria.³⁵ El PDI, tiene también una función de denitrosación, que resulta en la liberación de ON de compuestos donadores de ON y portadores de grupos tiol.³⁶ Mediante análisis proteómico y por “western blot”, se observa un aumento de PDI en la fracción de membrana en plaquetas de animales tratados con un fármaco vasolidatador, mientras que se reduce la forma secretada. Hay que remarcar que, en ambas funciones del PDI, participa el mismo centro activo³⁶, lo que parece indicar que, el tratamiento con el donador de ON, disminuye la secreción de PDI inducido por trombina, lo que llevaría a atenuar el activación irreversible inducida por este agonista plaquetar.

Perspectivas futuras

La integración de nuevas tecnologías en el área de genómica y proteómica funcional, se espera que proporcione una poderosa herramienta en el estudio de la biología plaquetar que permitirá identificar procesos biológicos complejos relevantes para la función plaquetaria y con repercusión en procesos patológicos mediados por plaquetas, como es el caso de la patología aterotrombótica o la enfermedad arterial coronaria.

Agradecimientos

Se agradece la financiación de CIBER OBENU CB06/03, SAF 2006/10091, FIS PI071070, REDINSCOR RD06/0003/0015 y Fundación de Investigación Cardiovascular- Catalana Occidente.

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